Marnix stamde uit een geslacht van magistraten uit het dorpje Marnix in de Savoye, die in dienst van Margaretha van Oostenrijk naar de Nederlanden waren gekomen. Hij was de broer van Jan van Marnix, heer van Toulouse. Hijzelf erfde van zijn ouders in 1558 de heerlijkheid Sint-Aldegonde in het graafschap Henegouwen. In 1578 kocht hij in het graafschap Zeeland ook de ambachtsheerlijkheid West-Souburg, samen met de resten van het bijhorende kasteel.

Marnix studeerde theologie in Leuven, Parijs, Dole, Padua en Genève. In deze laatste stad studeerde hij bij Calvijn en Beza en werd hij een overtuigd calvinist. Hij sloot zich in 1565 aan bij het Eedverbond der Edelen. Na de Beeldenstorm (augustus 1566) vluchtte hij naar Bremen, nadien naar Oost-Friesland waar hij diverse polemische stukken uitgaf. Het bekendste daarvan is De Byencorf der H. Roomsche Kercke (1569), een felle satire op de Rooms-Katholieke Kerk, dat tot het jaar 1761 ten minste 23 drukken beleefde.

Vanaf 1571 was hij in dienst van Willem van Oranje, wiens overgang tot het calvinisme hij bevorderde. Marnix werd een belangrijke medewerker van Willem, en voerde veel diplomatieke missies uit voor De Zwijger. Bij de Eerste Vrije Statenvergadering te Dordrecht was hij Willems afgezant. Tijdens de strijd tegen het Leger van Vlaanderen ("Spanje") (Tachtigjarige Oorlog) werd hij in 1573 door de "Spanjaarden" gevangengenomen; een jaar later kwam hij vrij na een uitwisseling van gevangenen.

In oktober-november 1576 bereidde Marnix de Pacificatie van Gent voor, waarbij Willems positie in de Nederlanden versterkt werd.

Van 1575 tot 1580 werkte Marnix aan een nieuw Nederlands psalter, waarvoor hij de Psalmen Davids rechtstreeks uit het Hebreeuws vertaalde. In 1591 verscheen een tweede gewijzigde druk en na zijn dood een derde. Het werk kon echter de populaire bundel van Petrus Datheen niet verdringen.

In 1583 benoemde Willem hem tot buitenburgemeester van Antwerpen en werd hem opgedragen de stad te verdedigen na de Spaanse Furie. Tegen de "Spaanse" overmacht onder Alexander Farnese was dit echter een schier onmogelijke opdracht. Als magistraat en militair blonk Marnix niet uit; daartoe miste hij Willems doortastendheid. Er is dan ook enige grond om hem de val van Antwerpen (augustus 1585) te verwijten. Marnix ging in die tijd zover ervoor te pleiten de gehele Nederlandse Opstand te beëindigen, waarna hij bij Willem en de Staten-Generaal wegens "verraad" in ongenade viel.

Teruggetrokken op zijn kasteel bij West-Souburg wijdde hij zich aan het schrijven. De Staten van Holland droegen hem in 1594 op de Bijbel te vertalen, waarvoor hij naar Leiden verhuisde, maar door zijn overlijden (1598) kon hij die klus niet klaren. Hij is in het koor van de Pieterskerk begraven.

Marnix van Sint-Aldegonde heeft een belangrijke bibliotheek nagelaten.